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    細胞外泌體來源和外泌體的表征方法

     更新時間:2023-01-10 點擊量:1024
    細胞外泌體來源及表征方法
    細胞外泌體是直徑為 30-150 nm 的血管外囊泡亞群。在過去的20年里,科學家已經從包括正常細胞和癌細胞在內的許多細胞類型中分離出外泌體,并且研究了它們對其他細胞的影響。外泌體是由多種大分子組成,例如核酸、蛋白質和脂質。

    細胞外泌體具有天然的特定細胞靶向特性,通常被設計用于靶向大分子(DNA 和 RNA)和藥物遞送系統(多柔比星、紫杉醇和紫杉醇)。目前常用細胞外泌體的分離方法主要是超速離心法、密度梯度離心法、超濾分離法、基于聚合物的沉淀法、親和沉淀分離法、  免疫磁珠法和色譜法等

    一、外泌體來源及其釋放途徑
    外泌體在人體的主要作用是充當局部和全身信號和調節系統。外泌體(直徑 30-150 nm)是較小的血管外囊泡亞群,它的還包括微泡(50 nm-1 μ m)和凋亡小體( 50 nm-5 μm)。

    外泌體的來源是內體系統。由內膜出芽形成早期核內體,早期內體可以與內吞小泡融合,從而引導它們的貨物進行回收、降解或分泌。當早期內體成熟為晚期內體時,在它們成熟為晚期核內體的過程中,囊泡膜向內出芽,導致多泡體 (MVB) 的產生,其中包含許多腔內囊泡 (ILV).  在此階段,MVB 可以與溶酶體融合(ILV 繼續降解)或與質膜融合,導致 ILV  釋放到細胞外空間。這些釋放的 ILV 稱為外泌體,包含著許多源自細胞內部的蛋白質、核酸、脂質和多糖 。 另一種釋放機制就是由于質膜向外出芽,從而導致形成所謂的脫落微泡或外泌體 。
     
    圖 1. 外泌體形成、釋放和細胞內化的方案

    二、 外泌體的表征方法
    根據藥物遞送系統 (DDS) 表征外泌體結構至關重要,因為它決定了 DDS 的特性,例如細胞或組織親和力、應激反應、吸收途徑和藥物釋放。 2014  年和 2018 年國際細胞外囊泡學會 (MISEV2018) 提出了外泌體(包括研究和外泌體制備)應滿足的基本要求指南。在開發基于外泌體的  DDS 時,必須考慮數量、大小、形態、膜組成和蛋白質(包括受體)等參數。這些參數表征所用的技術主要為光學、非光學和微流體技術。

    1.光學方法
    目前,光學方法是外泌體表征的主要方法,即動態光散射 (DLS)、多角度光散射 (MALS) 和納米粒子跟蹤分析 (NTA)  。這些方法允許對尺寸(DLS 0.5–200 nm;MALS 10 –500 nm;NTA 10–1000 nm )、尺寸分布和濃度進行高分辨率測量。 DLS 和 MALS 的結合增加了測量范圍 (0.5–500 nm)  和精度。光學方法比較受歡迎的,但缺點是靈敏度低、試劑消耗高以及需要昂貴的設備。
    在使用 納米粒子跟蹤分析NTA 方法過程中,熒光染料的加入也提高了分辨率,并允許通過使用熒光標記來表征表面免疫表型。從而確定標記物存在。

    2.非光學方法
    非光學方法主要包括掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、冷凍電子顯微鏡(Cryo-EM  )、原子力顯微鏡(AFM)、免疫檢測方法(ELISA)、傅立葉變換紅外光譜(FTIR  )、可調諧電阻脈沖傳感 (TRPS) 和單粒子干涉反射成像傳感器 (SP-  IRIS ) 。 SEM、TEM 和 AFM 方法通常用于直接膜結構和形態測定,而  ELISA 檢測提供各種結構顆粒(主要是蛋白質和受體)的檢測和量化,例如,用于外泌體形態的 確認。
       
    FTIR 光譜和衰減全反射 FTIR (ATR-FTIR) 常用于外泌體質量量化和脂質和蛋白質含量的總體估計。使用 TRPS  ,可以同時測量大小、濃度和 zeta 電位。由于掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡的成本較高,近些年來,一種新型的納米粒度分析儀器在外泌體研究領域迅速發展,比如 Nanocoulter粒度分析儀可以不僅可以進行 單顆粒檢測,顆粒粒徑檢測還可以檢測細胞外泌體的濃度、zeta電位、形態等進行多維度檢測。

    單粒子干涉反射成像傳感器 (SP-IRIS) 也用于外泌體定量,但也可用于檢測特定標記物和確定外泌體亞群. 

    3.微流體分析技術
    微流體技術在外泌體研究方面也起著推動作用。微流體技術不僅提供了高質量、高特異性的數據,并且試劑消耗量低,通量高. 

    基于微流體技術的研究方法需要結合使用微流控芯片,微流控芯片通常由玻璃基和聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 膜制成,包含許多尺寸適合所分析樣品的微通道。主要區別在于芯片的內表面,可以通過多種方式對其進行功能化,例如通過涂層、多層沉積、電沉積和  蝕刻. 目前研究中針對不同的微流控表征方法,也制造了不同類型的微芯片,包括免疫芯片、磁性芯片和電化學芯片。

    外泌體及其蛋白質也可以通過比色法(標記抗體/ELISA)、直接熒光染色( DiO 染料)  、電化學 性質變化和光學方法進行檢測。對于結果評估,還需要額外的設備,例如讀板器或熒光顯微鏡等.

    蘇州阿爾法生物14年專注于生物實驗室儀器和生物試劑 、實驗室耗材的專業供應商。提供的粒度分析儀、熒光顯微鏡等廣泛應用于細胞外泌體的研究。另外,提供的質粒提取試劑盒、PCR 試劑、一抗、雙抗、二抗、抗體蛋白、單克隆抗體、基因組提取試劑盒、RNA提取試劑盒、Qpcr試劑、培養基、胎牛血清等生物試劑也廣泛應用于生命科學實驗。
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